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 本刊论文 |
| 一株纤维素分解菌的分离鉴定及生物学特性 |
| 作者：唐红枫 时间：2016/09/16 点击：576 |
摘要:从土壤中分离出一株纤维素分解菌,对其进行了形态学、生理生化特性、生长曲线、酶活等生物学特性的初步研究。结果表明,该菌株为革兰氏阳性菌、短杆状;单菌落为浅黄色,能进行穿刺培养;最适碳源为CMC-Na,最适生长pH 7.2,最适生长温度为35 ℃,该条件下,以5%(V/V)的接种量,该菌株在纤维素培养基中生长48 h后纤维素酶活性达到最大值35.5 IU/mL。
关键词:纤维素分解菌;分离鉴定;生物学特性
中图分类号:Q93-331;Q935文献标识码:A文章编号:0439-8114(2014)11-2533-03
纤维素是地球上分布最广,含量最丰富的碳源物质之一,对人类而言,它既是自然界中数量最大的可再生资源,又是环境污染的源头之一。我国的纤维素资源极为丰富,据粗略统计,我国农作物秸秆年产量可达6亿t左右[1]。虽然纤维素废弃物的资源巨大,但是现阶段人们对其利用率极其低下,既造成了资源的浪费,又污染了环境。针对纤维素多而难利用的现状,从枯枝落叶中分离筛选到1株纤维素分解菌,对其进行形态学、生理生化特性、生长曲线、酶活等生物学特性的初步研究,为纤维素分解菌的鉴定及开发提供依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1土样土样采于武汉东湖学院九曲河河底淤泥。
1.1.2培养基
富集培养基:(NH4)2SO4 0.4 g,K2HPO4 0.2 g,MgSO4·7H2O 0.01 g,蛋白胨0.1 g,酵母膏1.0 g,用去离子水定容至1 000 mL,pH自然,试验中加入滤纸条。
选择培养基[2]:CMC-Na 5.0 g,硝酸钠1.0 g,硫酸镁0.5 g,磷酸氢二钾0.5 g,氯化钠0.5 g,氯化钾0.5 g,酵母膏0.5 g,去离子水定容到1 000 mL,pH 7.0~7.2。
鉴别培养基:CMC-Na 5.0 g,酵母膏 1.0 g,磷酸氢二钾 0.25 g,琼脂15.0 g,马铃薯100 mL,去离子水定容到1 000 mL,刚果红1 mL(10 mg/mL),pH 7.0~7.2。
牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏3.0 g,蛋白胨10.0 g,NaCl 5.0 g,琼脂15.0 g,去离子水定容到1 000 mL,pH 7.0~7.2。
半固体培养基:CMC-Na 5.0 g,蛋白胨5.0 g,硫酸镁 0.5 g,磷酸氢二钾1.0 g,氯化钠 0.5 g,硫酸铵2.0 g,琼脂5.0 g,pH 7.2~7.5,去离子水定容到1 000 mL。
CMC培养基:CMC-Na 10.0 g,硝酸钠1.0 g,硫酸镁0.5 g,磷酸氢二钾0.5 g,氯化钠0.5 g,氯化钾0.5 g,酵母膏0.5 g,去离子水定容到1 000 mL,pH 7.0~7.2。
1.2菌种的筛选
1.2.1纤维素分解菌株的富集培养取河底淤泥5 g,倒人装有50 mL无菌水的锥形瓶中,置于磁力搅拌器上搅拌10 min,静置1 h,取上清液10 mL加入到富集培养基中,摇床30 ℃培养3 d,待滤纸条崩解后进行纤维素分解菌的分离。
1.2.2菌种的初筛从上述富集培养液中取2 mL样品液注入CMC选择培养基中,摇床30 ℃培养24 h。
1.2.3梯度稀释将上述培养的菌液进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的梯度稀释。
1.2.4菌种的初筛分离将10-4、10-5、10-6三个稀释梯度的菌液涂布到鉴别培养基平板上,每个梯度设置3个平行,分别接种0.2 mL,培养48 h后观察,产生有透明圈的菌株即为纤维素分解菌株。
1.2.5菌种的复筛纯化培养将初筛分离出的水解圈最明显的菌株接种到鉴别培养基上,每菌株接种3个平板,30 ℃培养3 d,以进行复筛、纯化。
1.3菌株的形态观察
1.3.1个体形态观察取少量菌体制作涂片,干燥固定后进行革兰氏染色,油镜下观察菌体形态特征。
1.3.2群体形态观察在无菌条件下,将培养的液体培养基梯度稀释,然后将10-4、10-5、10-6三个稀释梯度的菌液分别涂布在CMC固体培养基上,30 ℃,倒置培养24 h,观察细菌在固体培养基上的生长特征,并记录试验结果。
在无菌条件下,将接种针拉直,挑取斜面活化的细菌,直接穿刺到半固体培养基的底部,20 ℃静置培养24 h,观察细菌在半固体培养基中的生长状况,检查细菌的运动性及需氧性,并记录试验结果。
1.4生理生化特性试验
1.4.1菌株在不同pH下的生长状况在CMC培养基中,分别用1 mol/L盐酸和1 mol/L氢氧化钠调pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,每个梯度3个平行,按照1∶20(V/V)接种活化的菌液,30 ℃静置培养24 h,测定600 nm处吸光度。
1.4.2细菌在不同温度下的生长状况设置20、25、30、35、40、45 ℃共6个温度梯度,每个梯度3个平行,按照1∶20(V/V)分别接种活化的菌液,30 ℃静置培养24 h,测定600 nm处吸光度。
1.4.3不同碳源下生长曲线的制作根据前期试验结论,采用该菌生长最佳的pH和温度,选取不同的碳源(葡萄糖和CMC)分别配置基础液体培养基。分别按照1∶20(V/V)接种活化的菌液,混合均匀后分别取5 mL混合液放入54支无菌试管中,37 ℃振荡培养,分别培养0、2、4、6、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、42、45、48 h,每组3个平行,用未接种的培养基作为空白对照,选用600 nm波长进行光电比浊测定,以生长时间为横坐标,吸光度为纵坐标作生长曲线[3]。
1.4.4菌株酶活的测定由于菌株产生的纤维素酶将纤维素分解为单糖,所以酶活的测定采用DNS法[4-7]。
2结果与分析
2.1产纤维素酶菌株的筛选结果
通过筛选试验,在鉴别培养基上,一些菌落周围有透明圈,其中一株菌株产生的透明圈明显,表明该菌株具有较强的分解纤维素的能力(图1)。
2.2形态学观察结果
革兰氏染色结果表明,该产纤维素酶菌株为革兰氏阳性菌,为短杆状。由图2可知,在CMC固体培养基上该菌株菌落呈现规则、浅黄色、圆形、边缘整齐、表面光滑、凸起、湿润不透明的特征。该菌株在半固体培养基中穿刺的形状为芜菁状。半固体培养基表面穿刺口长有该菌株,穿刺线模糊,说明该菌株为兼性厌氧型。
2.3菌株生理生化特性
2.3.1pH和温度对产纤维素酶菌株生长的影响由图3可知,产纤维素酶菌株在pH 6.0~8.0的范围内均能生长,在pH 6.6~7.5的范围内生长较好,适宜的pH在7.0左右。由图4可知,该菌在温度为20~40 ℃范围内均能生长,在温度为30~37 ℃范围内生长较好,适宜的温度为35 ℃。
2.3.2产纤维素酶菌株的生长曲线以葡萄糖为碳源,产纤维素酶菌株的生长曲线如图5。由图5可知,0~4 h为延滞期,出现的原因可能是菌种为适应新的环境条件,合成新的酶,积累必要的中间产物。该时期的特点为:①菌体生长速率常数接近零;②对外界条件、理化因素反应敏感。4~17 h为对数期,出现的原因可能是由于延滞期大量合成细胞分裂所需要的物质并且营养丰富,细胞分裂所需要的物质充足,细胞迅速分裂。在该阶段,菌体大量分裂,数量迅速增加。17~26 h为稳定期,出现的原因可能为:①营养物尤其是生长因子的耗尽;②营养物的比例失调;③碱、毒素等有害代谢产物的积累及次级代谢产物的反馈抑制作用;④pH、氧化还原电位等物理化学条件对菌体生长越来越不适宜。该时期的菌体生长的特点为:菌体生长速率常数等于零。26~29 h为衰亡期,出现的原因可能是:①营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累。②细菌死亡速率超过新生速率,整个群体呈现出负增长。③菌体在衰亡期的后期,由于部分细菌产生抗性会使细菌死亡的速率降低,因此仍有部分活菌存在。在该阶段,出现菌种死亡速率超过生长速率,并且细菌自溶,以及释放一些含碱性的有毒物质等。
产纤维素酶菌株在以CMC为碳源的培养基中的生长曲线见图6。比较图5和图6可知,在以葡萄糖为碳源和以CMC为碳源的培养基中该菌株均能生长得很好。不同的地方是,该菌株在以葡萄糖为碳源的培养基中的生长周期较在以CMC为碳源的培养基中短,在以CMC为碳源的培养基中该菌株的生长周期明显增长且延滞期的时间也较长,原因可能是种子菌株在接种到以CMC为碳源的培养基中后,培养的外在条件发生了较大的变化,纤维素酶可能是该菌株的一种诱导酶,菌体先要合成出纤维素酶后才能在CMC培养基中生长、繁殖,所以,在CMC培养基中延滞期和生长周期都较长。
2.3.3酶活的测定结果酶活的测定结果见图7。
由图7可知,产纤维素酶菌株在以CMC为碳源的培养基中培养48 h时,纤维素酶活性达到最大值35.5 IU/mL,另外,与该菌株在以CMC作为碳源的培养基中所测的生长曲线相对照可以看出,该菌株在以CMC为碳源的培养基中合成纤维素酶的能力与该菌株的生长状况表现基本一致,即随着纤维素酶合成的增加,该菌株的生长和繁殖能力越强。
3结论
试验首先从富含纤维素的外界环境(富含枯枝落叶的河底淤泥)中通过富集培养、分离鉴定等得到1株能够分解纤维素的细菌菌株,而后对其形态学、生理生化特性、生长曲线、产酶能力等进行了初步研究。
根据试验结果,初步证实该菌株为革兰氏阳性菌,形态为短杆状,营养类型为兼性厌氧型。该菌株的最适生长温度为35 ℃,最适生长pH 7.0左右。另外,分别在以葡萄糖和CMC为碳源的环境中对其进行生长情况的观测,发现该菌株在以CMC为碳源的培养基中延滞期较长、生长周期也较在以葡萄糖为碳源的培养基中长。初步推测,纤维素酶为该菌株体内的一种诱导酶,只有当环境中葡萄糖消耗完时,该菌株细胞内才开始合成此酶,同时,测定该菌株在CMC培养基中生长48 h时纤维素酶活性达到最大值,为35.5 IU/mL。
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